大多数细胞生物学实验使用短暂转染方案，在转染后的24-96小时内达到基因表达的峰值。然而，如果需要长时间持续的基因表达，构建稳定的细胞系是一个可行的选择。此外，通过限制稀释选择的稳定细胞系提供了遗传同质和克隆的细胞群体。
稳定细胞系的构建可以通过使用阳性选择标记物（如 hygromycin、G418/Geneticin、zeocin 和 blasticidin 抗生素耐药性）来实现。选择标记物可以通过与目标基因在同一质粒上（cis 方式）或与含有目标基因的质粒共转染（trans 方式）来传递。cis 方法通常较为简单，并且更有可能产生抗药性稳定转染体，表达目标基因。当目标构建在质粒骨架中不含抗生素耐药基因时，trans 共转染方法是一个很好的选择。在这种情况下，可以将含有5至10份基因表达质粒和1份抗生素选择标记质粒的质粒混合物引入细胞中。这种质粒比例有助于确保所选细胞同时表达目标基因和选择标记物。
1. sgRNA 验证：在实验开始前，可以通过 sgRNA 在线验证，筛选高效率的 sgRNA 用于敲除细胞系的构建。
2. 基因拷贝数：建议在开始实验之前确定目标基因的拷贝数。
3. 质粒质量：使用高质量无内毒素的质粒 DNA。
4. 细胞条件：使用维护良好并经过常规认证的高质量细胞，包括检测细菌，真菌或支原体污染。如果细胞来自新复苏的细胞，则在使用前至少完成2次传代。
5. 设计和合成 sgRNA 和基因型引物。
6. 用 Cas9 和 sgRNA 转染细胞。
7. 使用适当的选择标记筛选敲除细胞。
8. 单细胞克隆分离。
9. 使用 PCR 和测序筛选克隆以确认敲除。
10. 扩增阳性克隆。
11. 通过 Western 印迹或其他方法验证敲除。
12. 检测支原体污染并冻存稳定敲除细胞。
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