小泛素化修饰（SUMO）是通过E1，E2和E3三种酶调控的酶级联反应将其连接在底物上。Ubc9E2酶的活性部位，通过识别底物上特定的共识四肽序列ѱKXE（ѱ,疏水氨基酸; K, 目标赖氨酸, X, 任意氨基酸, and E, 谷氨酸），并与其发生连接反应。迄今为止，SUMO化受体位点通过目标氨基酸残基上的共识四肽序列被广泛识别。
通过近期的蛋白质组学研究表明，相当比例的SUMO化蛋白不包含共识位点，并且不能通过传统突变方法获得。此外，还有方法提出一种非共识的SUMO靶向模型，其中SUMO-Ubc9的硫酯集团被位于底物上的SUMO相互作用基序（SIM）所募集。然而，针对靶向非共识底物的机制仍然未明确。因此需要能够无偏倚鉴定SUMO化修饰位点的新方法。
胰蛋白消化的哺乳动物SUMO化修饰蛋白，在目标赖氨酸残基上产生了较长侧链的一段肽段序列（图1A），目前常用的蛋白质组学手段，并不能很好的应用于这些分支肽段序列的鉴定，相比较线性多肽比较，在质谱中呈现较高度复杂的片段化模式。
图1
解决这一个问题的方法是在SUMO-1蛋白的C末端进行苏氨酸-精氨酸替代（T95R），精氨酸残基导致长侧链被胰蛋白酶水解，而赖氨酸残基上有两个甘氨酸残基作为标志性标签（114.0429Da）,它代表了SUMO化修饰位点集团。由于检测灵敏度低，且缺乏针对复杂胰蛋白酶消化系统中含SUMO化位点的特异性纯化寄出，因此该方法具有较大问题和挑战性。
为了便于在体内识别SUMO化修饰位点，下面有报道开发了一种新的组合策略，使用进一步重组的SUMO-1蛋白。
除了易于检测的标签，该策略还具有富集SUMO化肽段的能力。在Hela细胞中应用这种底物无偏倚的方法，最后鉴定到了共识和非共识的SUMO化位点，提供了一种SUMO化修饰位点的鉴定的新手段。
为了便于在体内鉴定到蛋白的SUMO化位点，开发了一种基于改良的半胱氨酸标记形式的SUMO化蛋白富集手段。（图1B）
图1B
通过使用两种不同的蛋白酶，LysC酶可以使蛋白消化后以富含半胱氨酸为支链，可以通过与巯基特异性树脂(Thiopropyl-Sepharose 6B）的共价结合而被特异性保留。而通过胰蛋白酶则总固定半胱氨酸标签中释放出目标肽段。结果在赖氨酸残基上获得了含有两个额外质量的甘氨酸残基的肽段，从而可以用质谱方法鉴定SUMO化修饰位点。
这里所采取富集方法使用了可去除的胱氨酸标签，大大提高体内的SUMO化位点鉴定的可能性。类似于磷酸化肽段富集可使磷酸化蛋白质组学发展的情况，对于SUMO化修饰肽段的富集，同样可能拓展SUMO化修饰蛋白组学的研究领域。
综上所述，此方法是一种有效研究SUMO化修饰位点的新思路，并且这种方法可以应用于各种研究领域，它的开发将有利于解开SUMO修饰的机制以及识别不同SUMO修饰类型。
文献出处：Proteome-wide identification of SUMO modification sites by mass spectrometry
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