用于细胞中蛋白质s-异戊烯化的检测方法
蛋白质s-异戊烯化是一种调节细胞信号传导中膜-蛋白和蛋白-蛋白相互作用的脂质修饰。尽管可以根据保守的c端CaaX或CC/CXC基序来预测蛋白质s-戊烯酰化的位点，但细胞中蛋白质s-戊烯酰化的生化检测仍然具有挑战性。本文中，我们报道了一种烷基异戊二醇化学报告蛋白(alk-FOH)作为哺乳动物细胞中戊烯基转移酶的有效底物，可以使用生物正交连接方法灵敏地检测s-法酰化和s-香叶酰化蛋白。荧光检测减轻了对s-戊烯基化蛋白进行生化分析时消耗细胞类异戊烯的需要，并能够对s-戊烯基化蛋白(如细菌病原体注入宿主细胞的效应物)进行稳健的表征。这种炔基戊烯酰化报告基因为细胞中戊烯酰化蛋白的生化分析和快速分析提供了一种灵敏的工具。
s-异戊烯化是一种翻译后的脂质修饰，它控制着许多蛋白质的膜靶向，这些蛋白质是基础细胞信号通路和疾病(如癌症和微生物感染)的基础。s-异戊烯化是指通过硫醚连接将法尼基(15碳)或香叶基(20碳)类异戊二烯脂链在位于c端或c端附近的一个或两个半胱氨酸残基上的蛋白质翻译后安装。
图1
s-戊烯基化蛋白的重要性促使了对其生物合成途径的剖析。s-异戊烯化的前体来源于类异戊二烯焦磷酸盐底物。法尼基转移酶(FTase)催化法尼基二磷酸(FPP)转移到蛋白质上，同时释放游离的二磷酸(图A)。香叶基转移酶1型和2型(GGTase-I和GGTase-II)使用香叶基二磷酸(GGPP)作为底物(图A)。FTase和GGTase-I识别c端CaaX基序，其中C是修饰的半胱氨酸，“a”是脂肪氨基酸，X决定了FTase(倾向于Cys,Met,Ser,Ala和Gln)或GGTase-I(倾向于Leu和Phe)的选择性，尽管这一规则并不严格例如，K-Ras(具有CVIM或CIIM基序)在法尼基转移酶抑制下在体内变成香叶基基化，而RhoB(具有CKVL基序)已知在体内既具有法尼基化又具有香叶基基化在细胞质溶胶中发生异戊烯化后，CaaX蛋白被募集到内质网，在内质网中，CaaX异戊烯蛋白酶2(RCE1)切割aaX三肽，异戊酰半胱氨酸羧甲基转移酶(ICMT)甲基化新暴露的半胱氨酸c端羧酸。GGTase-II(也称为RabGGTase)专门修饰Rab蛋白，并需要Rab护送蛋白(REP)呈递Rab蛋白的c端CC或CXC双半胱氨酸，从而获得双香叶酰化(图A)。带有c端CXC基序的Rab蛋白也会被羧甲基化。基于保守的CaaX-box和CC/CXC基序，生物信息学分析预测了哺乳动物蛋白质组中数百种s-戊烯基化蛋白为了更好地理解s-戊烯基化蛋白在细胞信号传导中的作用，对蛋白质异戊烯化途径的生化解剖引发了人们对开发强大检测方法的极大兴趣，但仍然存在挑战。
炔基法尼醇(alk-FOH，图C) 化学报告物是细胞中FTase和 GGTases容易接近的底物，并且可以使用铜(I)催化叠氮化物- 炔环加成 (CuAAC)方法对s -法尼化和s -香叶酰香叶酰化蛋白进行敏感的荧光检测。
我们在法尼醇的基础上设计了炔基异戊二醇化学报告物，因为相应的化学报告物是FTase和GGTase-I的底物我们采用了一种合成方案，可以从一个共同的中间体中获得各种各样的烷基法尼醇衍生物(alk-FOH、alk-FOH-2和alk-FOH-3)，以及叠氮化物类似物(az-FOH)，以进行比较(图2)。市售的法尼醇可以选择性地在末端烯丙基位置氧化，得到功能化的法尼醇衍生物。然后，烯丙醇1与丙炔溴烷基化，并在酸性乙醇中去保护，生成alk-FOH，这是先前报道的炔基法尼醇二磷酸的前体，在体外可以通过FTase和GGTase-I结合到肽底物上烯丙醇1的Corey-Kim样卤化使烯丙基溴中间体3得以获得。CuI/K2CO3介导的与tms-乙炔的偶联产生了炔4，随后分两步去保护得到alk-FOH-2。或者，烯丙基溴3与锂化的tms-1-丙炔烷基化得到烯5，脱保护后得到比alk-FOH-2长一个亚甲基单位的alk-FOH-3。Az-FOH也以类似的方式用叠氮化钠取代溴化3，然后进行THP脱保护。
图2
我们专注于alk-FOH，因为与其他炔基法尼醇报告物相比，这种化学报告物易于合成且稳定。然后在HeLa细胞中，用每种戊烯基转移酶的已知底物蛋白检测Alk-FOH，这些细胞瞬时表达FTase的Ras,GGTase-I的RhoA和GGTase-II的Rab7。三种蛋白均用alk-FOH标记。此外，用FTase抑制剂(FTI-277,10μM)孵育细胞时，观察到Ras信号的选择性衰减，用GGTase-I抑制剂(GGTI-2133,10μM)孵育细胞时，观察到RhoA信号的选择性衰减，而在Rab7的情况下，信号不受影响。这表明alk-FOH可以作为细胞中所有三种戊烯基转移酶的底物，因此是检测蛋白质s-异戊烯化的有用工具。
炔基法尼醇(alk-FOH，图1C)化学报告物是细胞中FTase和GGTases容易接近的底物，并且可以使用铜(I)催化叠氮化物-炔环加成(CuAAC)方法对s-法尼化和s-香叶酰香叶酰化蛋白进行敏感的荧光检测。
炔基法尼醇alk-FOH是细胞中s-戊烯基化蛋白的有效化学报告因子。与先前报道的检测方法相比，实现了若干改进。Alk-FOH是稳定的，易于通过化学合成获得，并且是哺乳动物细胞中所有三种戊烯基转移酶的底物。重要的是，HMG-CoA还原酶抑制剂不需要用于内源性戊基化蛋白的alk-FOH检测，凝胶内荧光检测可以避免将疏水蛋白转移到膜上。我们的方法首次在细胞中检测到SifA戊酰化，这揭示了沙门氏菌T3SS效应SifA的稳健和异质戊酰化。总的来说，这里提高的灵敏度应该有助于细胞中蛋白质s-戊烯酰化的生化和功能分析。
